基于B-factor饱和突变法筛选热稳定性伯克霍尔德菌脂肪酶A突变体

Thermostable Lipase Variants Constructed via B-factor Saturation Mutagenesis Method

作者: 专业:微生物学 导师:刘艳如 年度:2015 学位:硕士  院校: 江西理工大学

Keywords

        伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.) ZYB002脂肪酶A在机械浆造纸工艺中,能有效控制树脂障碍的产生。在实际应用中,机械浆温度高达80℃,因此进一步提高脂肪酶LipA的热稳定性,是提高脂肪酶使用效果,将其更好地应用于造纸工艺中的先决条件。本论文以酶分子晶体结构的B值(B-factor)高低作为筛选突变位点的准则,快速确定影响脂肪酶热稳定性的关键性氨基酸残基,利用蛋白质工程技术改造脂肪酶分子,以期获得热稳定性LipA突变体。具体实验结果如下:1、在PDB数据库中已有9个洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)脂肪酶LipA的晶体数据。经对其进行逐一评估后,选择3LIP作为构建本Burkholderia sp.ZYB002脂肪酶 LipA的模板。通过氨基酸序列比对,结合B-FITTER软件筛选出本论文将进行的突变氨基酸残基位点,分别为F221、V220、L218、V223和E35。2、设计NNK简并性引物(20种氨基酸/32种密码子),构建上述突变氨基酸残基的突变文库。经过初筛和复筛,从5个突变文库中分别筛选到在55℃下,半衰期较野生型脂肪酶LipA分别提高了3倍、2.2倍、1.7倍、1.5倍和1.8倍的脂肪酶突变体(LipA-F22D、LipA-V220E、LipA-L218E、LipA-V223D和LipA-E35P)。3、β-turn是蛋白质二级结构中非常重要的一种结构,其稳定性在一定程度上影响着整个蛋白质的稳定性。通过探索纯化条件,在1% Triton X-100和7mol/L尿素处理下利用Hi Trap DEAE FF离子交换层析柱和His TrapTM HP亲和层析柱分别对野生型脂肪酶和三个位于β-turn上的突变体脂肪酶(LipA-V22P、LipA-F221P和LipA-V223S)进行分离纯化,SDS-PAGE电泳鉴定,脂肪酶大小为34 kDa。
    
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