拟南芥pipe恢复突变体LL-2的研究及PIPE的定点突变

Study of a Rescued Arabidopsis Pipe Mutant LL-2 and PIPE Site-Directed Mutagenesis

作者: 专业:细胞生物学 导师:侯岁稳 年度:2013 学位:硕士  院校: 聊城大学

Keywords

        本实验室使用EMS(甲基磺酸乙酯)诱变处理拟南芥,筛选得到一个与表皮细胞发育相关突变体pipe。通过图位克隆的方法克隆到目的基因,该基因编码一种蛋白磷酸酶。本实验在pipe突变体的基础上,经EMS二次诱变,从中筛选得到能够部分恢复pipe突变体矮化表型的株系LL-2。与pipe匕较,LL-2植株明显增高。pipe突变体的莲座叶叶序发生变化,叶片狭小、不规则卷曲,LL-2的莲座叶叶序恢复正常,叶片不具有卷曲现象,但是莲座叶的数目较野生型少。与野生型相比,pipe的莲座叶下表皮扁平细胞明显呈砖块状排列,不具有指状交错的形态,LL-2莲座叶下表皮的扁平细胞呈指状交错排列,恢复为野生型表型。遗传分析证明LL-2突变基因与PIPE基因紧密连锁。对LL-2突变基因进行定位,发现PIPE基因的第547位碱基由C变为T,对应的第183位的氨基酸由组氨酸变成酪氨酸。通过酵母双杂实验,验证PIPEH183Y-BD.PIPEH183YT246M-BD与DELLA的蛋白互作。构建35S-PIPEH183Y-GFP、35S-PIPEH183YT46M-GFP载体,转入野生型和pipe,观察转基因植株表型,发现无明显变化。另外,为了进一步研究PIPE的功能,本论文还定点突变该基因的三个活性位点,构建点突变载体并转入野生型或pipe突变体中,发现转基因植株在表型上与野生型或pipe突变体差别不大。此外,本实验还探讨了拟南芥中CKI(I型酪蛋白激酶)对GA信号途径的影响。对拟南芥中CKI三个同源性较高的激酶基因的T-DNA插入株系进行了鉴定,初步发现激酶的T-DNA插入并不能恢复pipe的表型,表明CKI可能没有参与GA信号途径中DELLA的调节。
    
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