激活标签法构建拟南芥T-DNA插入突变体库及D-Ala抗性突变体的筛选

Construction of Arabidopsis Activation Tagging T-DNA Insertion Mutant Library and the Screening of D-Ala Resistant Mutants

作者: 专业:采矿工程 导师:查向东 年度:2011 学位:硕士  院校: 西安邮电学院

Keywords

        随着生物科学的快速发展,以基因生物学功能鉴定为目标的后基因组学(postgenome)成为基因组学研究的重点,而突变体在基因生物学功能研究中起着重要的作用,是其研究的重要材料,因而通过构建饱和的突变体库,是基因生物学功能研究的最直接而有效的方法之一。拟南芥(Arabidopsis thaliana),十字花科(Brassicaceae)一年生草本植物,因其具有一些独特的遗传学及分子生物学特性(如个体小、生长周期短、种子繁殖系数高、易于人工诱变及遗传转化等特点),被作为植物分子遗传学研究中最受欢迎的模式植物,随着其基因组测序的完成,拟南芥已成为基因生物学功能研究的焦点,但其90%的基因功能仍未被鉴定。丙氨酸(alanine)作为蛋白质氨基酸,参与蛋白质的组成,由于其原子空间的排布位置不同,又有两种构型:D-型和L-型。天然蛋白质的氨基酸构成都是L-型,而现研究发现D-型氨基酸在植物代谢中受到强烈的抑制,对生物机体有一定的毒害作用,如D-丙氨酸和D-丝氨酸,或认为反馈抑制或竞争性抑制,但人们对其相关机理方面的认知尚少,只在植物方面有少许研究。本实验主要通过构建功能获得型突变体库,从中筛选D-丙氨酸抗性突变体,进行突变基因定位和克隆,以初步研究其功能。以哥伦比亚(Columbia,Co1)野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)为实验材料,通过激活标签法(用含有激活标记双元质粒pCB260的农杆菌浸花进行转化)构建了T-DNA插入突变体库。从中筛选到D-丙氨酸抗性突变体,并通过Tail-PCR方法成功将T-DNA插入位点的侧翼序列扩增,得到与D-丙氨酸抗性相关的几个候选基因,主要结果如下:(1)本实验中,以Columbia(Col)野生型拟南芥为实验材料,将构建的双元载体pCB260转化农杆菌菌株GV3101,利用浸花法(floral dip)大规模侵染转化野生型拟南芥植株,经除草剂Basta筛选获得具有其抗性的T-DNA转化植株,目前已筛选到Basta抗性植株总约20,000株,其突变表型主要涉及植株株型、叶形的变异,花期、育性的改变,及种子颜色的差异等。并对其中表型存在显著差异的部分突变体植物进行了突变基因的定位及初步的分析。(2)首先通过D-丙氨酸的浓度梯度实验,确定了D-丙氨酸抗性突变体筛选的标准浓度(4mM)。以所构建的T-DNA插入突变体库中的突变体为筛选材料,筛选到6株具有D-丙氨酸抗性的突变体(A22, A36, A15, A20, A24, A43),并将T2代种子在含3mM D-丙氨酸的MS培养基上复筛,以确定其对D-丙氨酸的抗性。并发现D-丙氨酸对Columbia(Col)野生型拟南芥的胁迫作用与培养基中的硝酸盐的含量相关,随着硝酸盐含量的增加,植株生长受胁迫的现象有所减弱。(3)采用Tail-PCR方法,成功将突变体(A22,A36,A15,A20,A24,A43)T-DNA插入位点的侧翼序列扩增,经NCBI数据比对,其T-DNA插入位点分别为位于2号、5号、2号、1号、3号染色体不同基因。而后对感兴趣的突变体A22和A36做了进步表型上的鉴定,结果发现突变植株对D-丙氨酸具有一定的抗性,说明其突变基因可能参与了拟南芥植株对D-丙氨酸的抗性。利用三引物法,对T-DNA插入位点进行了验证,并在T3代中鉴定到纯合突变体体。
    
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