基于DNA条形码—产地—形态分析的药材鉴定方法及巴西草药品种整理研究

作者: 专业:中药生药学 导师:刘春生 年度:2015 学位:硕士  院校: 北京中医药大学

Keywords

        在拉丁美洲,巴西是最大的国家,具有广袤的农田、辽阔的雨林和丰富的植被宝藏。巴西已有基于单味植物药保健品药品投向市场,且产生了相当大的经济效益,巴西苏木、甜叶菊等药材已经广泛用于国内外保健产品与临床医疗。20世纪的一项调查表明,巴西的植物药有30%的种类与我国同种或同属,对巴西草药的开发利用研究,有利于引进和丰富中药资源;巴西政府也十分热衷于了解和应用中医药的临床技术和方法。加大与巴西的贸易合作和科研合作,加大对巴西草药的开发研究,有利于中巴两国的经济互利互惠,资源共享及医疗水平的共同进步。巴西早有应用草药的传统,但对草药的研究尚处于初级阶段,对植物学和草药研究还不够深入,对巴西草药的品种整理研究对保证巴西草药的准确使用和开发利用具有重要意义传统的品种整理方法主要是运用文献学研究方法结合民间走访调查、鉴定原植物的形式研究,该法是品种整理的基本方法,但是该法存在耗费时间、所用周期长、人力、物力消耗大的缺点。随着分子生物学的发展,DNA条形码技术为物种鉴定提供了新的依据,其准确、高效、快速、能鉴别无背景信息物种的优点受到越来越多的人的重视。其中,ITS序列鉴别效率高,在物种鉴定中得到广泛应用。但是该法还存在鉴定标准不明确、数据库不完善、样品DNA提取质量差和不易扩增等缺点。本研究充分结合传统品种整理的优势,结合分子生物学技术,提出“DNA条形码-产地-形态分析的品种整理方法”,能够对巴西市场中销售的10种草药进行品种整理,以达到市场品种整理的目的。本研究根据NCBI核酸数据库建立分子鉴定指标,利用DNA条形码技术结合产地分析和形态分析建立了药材品种整理方法,对巴西市场上缺少背景信息的草药进行品种整理,为巴西草药的开发应用提供依据。主要研究结果如下:(1)比较了30种植物标本的相似度分析方法和系统发育树分析法鉴定的准确性、操作效率和操作条件,结果表明,相似度分析法均优于系统发育树法;相似度分析法的鉴定准确率达到73%,系统发育树法鉴定准确率为53%,相似度分析法的准确率高,系统发育树法的优势是序列筛选时能有效排除部分错误序列,使一些鉴定结果更准确;相似度分析法的鉴定准确率与两法合用相比仅低了7%,但在操作效率和操作条件上具有明显优势。因此,本研究在后续研究中选择相似度分析法。使用相似度分析法依赖于强大的数据库支持,当数据库数据不完全时,为了避免错误鉴定,应设定阈值界定同一物种的最低相似度,低于阈值,认为数据库未注册该序列。(2)2010版《中国药典》中的基原物种在NCBI核酸数据库中注册4条以上序列的物种有220个,下载这些物种的所有ITS序列,并计算相似度,并统计大多数(70%)物种的不同注册序列的最低相似度作为阈值,结果表明,大多数物种的最低相似度为97%;30种植物标本ITS序列检验阈值的准确性研究表明,除了喀什小檗和尖叶假龙胆2个NCBI未注册的物种外,其他序列的最高相似度全部在97%以上,因此,将97%设定为阈值,采用相似度法鉴定时界定同一物种的最低相似度,低于阈值时,认为数据库未注册该物种序列。(3)为了获得药材中的ITS序列,通过优化DNA提取方法和PCR扩增方法得到ITS序列。分别采用优化试剂盒法、核分离液预处理法、经典CTAB抽提法和分段扩增法提高ITS序列的获取效率。结果表明,65%的药材通过优化试剂盒法提取DNA能得到合格的DNA;核分离液预处理去除杂质未能提高DNA扩增效率,经典CTAB抽提法和分段扩增法能提高ITS序列的获取效率。(4)采用上述采集的标本,取入药部位作为本章的中药材材料,以97%为阈值界定同一物种的最低相似度,按照相似度分析法依次分析从高到低的相似度物种的产地分布和形态特征,建立DNA条形码-产地-形态分析方法的药材鉴定方法。(5)基于DNA条形码-产地-形态分析的药材鉴定方法对巴西草药进行品种整理。首先,通过DNA条形码技术获得样品ITS序列,对无背景信息的巴西草药进行品种整理,以97%为阈值,对种水平进行鉴定,以相似度最高物种为鉴定结果;当没有相似度在97%以上的物种时,认为该数据库未注册相应序列,以90%为阈值,对科属水平进行鉴定,得到初步鉴定结果。然后,根据DNA条形码鉴定结果,参考《巴西植物志》及医药文献分析相似度最高的物种是否在巴西生长,如果在巴西分布,则可能为鉴定结果;如果不在巴西分布,则该物种不是鉴定结果,分析下一个相似度最高的物种,直到得到相似度在97%以上且在巴西分布的物种为鉴定结果;如果没有符合条件的鉴定结果,则鉴定到科属水平。最后,按照《中国药典》中性状鉴定和显微鉴定的方法核对DNA条形码和产地分析的鉴定结果,并确定巴西草药的入药部位。该方法能够从市场入手,实现10种巴西草药的属、种水平的品种整理,并能确定入要部位,为巴西草药的品种整理提供依据,为进一步研究和发现中药的新治疗作用提供参考,对我国中药产业扩大资源具有重要意义。
    
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