sAA糖基化和总含量测定方法及其含量与活性关系的研究

Study for the Determination Method of the Total sAA Content and sAA Glycosylationand the Relationship between Activity and Content

作者: 专业:病原生物学 导师:何震宇 年度:2013 学位:硕士  院校: 广东药学院

Keywords

        目的:脾虚症唾液淀粉酶(sAA)酸刺激后/前活性比值较正常人低,作为中医脾虚证的辩证诊断参考指标被用于中医基础和临床研究,然而,脾虚症唾液淀粉酶活性改变的机制尚未研究清楚,本文主要从影响sAA活性的sAA含量和糖基化水平进行研究,建立WB测定sAA糖基化和总量的方法并对sAA活性与sAA糖基化及总量的相关性进行分析,以期为中医脾虚证酸刺激前后sAA活性改变机制中蛋白表达方向相关研究提供方法学参考。方法:1规范柠檬酸刺激采集唾液的方法;2采集柠檬酸刺激前后健康成人、儿童和脾虚儿童的唾液样本,检测唾液pH、唾液流率,主要通过EPS-G7速率法测定sAA活性,BCA蛋白试剂盒检测唾液总蛋白浓度,Western Blot测定sAA总量和糖基化sAA含量,计算比活,对sAA活性与sAA总量和糖基化含量相关性分析。结果:㈠采用0.4mol/L1×1cm柠檬酸滤纸刺激下,唾液流率(刺激时:1.4944±0.5692mL/min;刺激后:0.8528±0.4047mL/min)和sAA活性比值(刺激时:1.5571±0.4585;刺激后:1.7246±0.4527)增加最为明显(P<0.05);㈡测定sAA活性时,EPS-G7速率法,变异系数(CV)基本控制在5%以下,而碘-淀粉比色法的CV都在10%以上,并且有一半在30-48%;㈢Western Blot技术DAB显色方法得到糖基化sAA含量占总sAA20%-30%;㈣健康成人和儿童酸刺激后,唾液pH、唾液流出率、sAA活性、sAA浓度、糖基化sAA浓度、比活都增加,其中儿童增加更为明显(P<0.05)。这些指标酸刺激后与酸刺激前比值,成人比儿童的小。另外,成人酸刺激前、后sAA活性都比儿童的高。酸刺激后,成人唾液总蛋白浓度显著降低(P<0.05),而儿童则有增加的趋势。㈤脾虚儿童酸刺激后,唾液pH、唾液流出率、sAA活性、sAA浓度、糖基化sAA浓度、比活都增加,但这些指标酸刺激后与酸刺激前比值,除唾液总蛋白浓度和sAA浓度变化不明显外,脾虚儿童都小于健康儿童。另外,脾虚儿童酸激刺前sAA活性、唾液总蛋白浓度、sAA和糖基化sAA浓度和比活均大于健康儿童酸刺激前相应值。㈥健康成人、脾虚儿童的sAA活性与sAA和糖基化sAA浓度的相关性和健康儿童sAA活性与糖基化sAA浓度的相关性均为酸刺激后大于酸刺激前,健康成人sAA活性与sAA浓度的相关性为酸刺激后小于酸刺激前,其中健康儿童:酸碱前sAA活性与sAA浓度相关性较高(R=0.697),酸刺激后sAA活性与糖基化sAA浓度的相关性较高(R=0.503)。结论:⑴成功规范了柠檬酸滤纸刺激采集唾液的方法即选择0.4mol/L1×1cm柠檬酸滤纸刺激1min,收集刺激后2min全唾液;确立了测定sAA活性更稳定的EPS-G7速率法;成功建立了WesternBlot测定sAA含量及糖基化含量的方法,为sAA活性改变机制的研究提供了方法学的参考。⑵脾虚儿童酸刺激前sAA活性大于健康儿童,酸刺激后/前的sAA活性比值比健康儿童低,与临床脾虚证辩证理论一致,进一步证明了实验方法的准确可靠。⑶酸刺激前后sAA活性与含量的相关性存在差异,且均呈现明显的正相关。sAA含量和糖基化水平都是影响其活性的因素。
    
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